Program: L-V: 09-19 | S: 13
Luni-Vineri 08:00-19:00 | Sambata 08:00-13:00
contact@citobiomed.ro

Analize ADN (PCR-REALTIME)

Examenul PCR clasic și PCR real-time

PCR clasic se bazează pe determinarea unei consecutivități ADN a agentului patogen prin utilizarea primerilor complementari cu amplificarea ADN-ului matriță și identificarea lui prin electroforeză.

Reacția de polimerizare in lanț a fost descoperită cu aproximativ 40 ani în urmă de către A. Cornberg care împreună cu alt laureat al premiului Nobel (J. Lederberg) au concluzionat că, cu ajutorul acestei reacții se pot obține cantități mari de ADN.

Această idee a fost realizată ulterior după 20 ani de către Carry Mullis. Astfel, acesta din urmă, bazându-se pe procesul natural al replicării ADN-ului, a elaborat o metodă cu ajutorul căreia se pot obține copii ale anumitor secvențe genetice în cantități nelimitate într-un tub (in vitro).

Pe parcursul anilor PCR a suportat multiple modificări, scopul acestora fiind creșterea sensibilității metodei de diagnostic.

Astfel în zilele noastre PCR a ajuns sa dețină cea mai înaltă sensibilitate din toate metodele de diagnostic (aproximativ 98%).

pcr-2
pcr-3

PCR (reacția de polimerizare în lanț) se desfășoară în 3 etape:

  1. Denaturarea: în urma încălzirii amestecului de reacție la 94ºC, ADN-ul țintă este separat (denaturat) în 2 catene;
  2. Hibridizarea primerilor: ca urmare a scăderii temperaturii la 55-70ºC, primerii se vor atașa complementar la capetele 3’ ale celor 2 catene;
  3. Elongația: la temperatura de 72ºC, ADN polimeraza termostabilă în prezența Mn2+ și a excesului de deoxinucleotid-trifosfati (deoxiadenozina, deoxiguanozina, deoxicitidina și deoxiuridina), va extinde primerii atașați în lungul matriței țintă și va produce un amplicon ADN. Analizorul va repeta automat acest proces pentru un număr stabilit de cicluri (de obicei 30-35), la fiecare ciclu dublându-se cantitatea de amplicon ADN.

La rândul său, procesul global de amplificare desfășurat de-a lungul unui număr definit de cicluri poate fi divizat in 3 faze:

  1. Exponențială: la fiecare ciclu se dublează cantitatea de amplicon ADN (se admite o eficiență de 100% a reacției);
  2. Lineară: pe măsură ce componentele reacției sunt consumate, se produce o încetinire a reacției, iar produșii PCR încep să se degradeze;
  3. Platou (end-point): reacția este stopată, nu se mai formează alți produși de amplificare, iar dacă faza se prelungește mult, produșii PCR vor suferi o degradare importantă.

Metodele PCR tradiționale (convenționale) au la bază o detecție a produșilor PCR în faza de platou a procesului (detecție end-point). În ultimii ani, tehnologia PCR a fost revoluționată prin dezvoltarea metodelor de detecție în faza exponențială (detecție în timp real: real-time PCR).

Tehnologia PCR real-time

Tehnologia PCR real-time a fost posibilă datorită succeselor tehnologiilor fluorometrice și a utilajului ce permite determinarea concentrației ampliconilor nemijlocit în timpul reacției. Metoda se bazează pe măsurarea semnalului fluorescent în fiecare ciclu de amplificare. Intensitatea semnalului este proporțională cu concentrația produsului final al PCR. Această metodă de diagnostic prezintă numeroase avantaje față de cea convențională cum ar fi: acuratețe mai mare a rezultatelor obținute (efectuarea detecției se realizează în faza precoce a reacției), respectiv în faza de creștere exponențială a amplificarii când se produce o dublare exactă a cantitații de amplicon la fiecare ciclu, detecția în acest moment este optimă în sensul că rezultatele se corelează mai bine cu nivelul inițial al țintei comparativ cu tehnica PCR conventională (clasică) unde detecția are loc în faza de platou după ce reacția a fost stopată, iar produșii au început să se degradeze.

Este demonstrat faptul ca majoritatea agenților patogeni care cauzează infecțiile sexual transmisibile nu se pot diagnostica prin metode uzuale de diagnostic sau pur și simplu nu sunt detectați, așa numitele diagnostice fals-negative. PCR real-time ne permite să decelăm ADN-ul unui agent patogen țintă chiar și în cantități foarte mici, ceea ce face din această tehnică una de elecție pentru depistarea majorității agenților patogeni ce cauzează inflamațiile urogenitale.